第1章概述
7000年前，我国仰韶文化时期就己经会利用发酵技术制作美酒。大约公元前221年，我国劳动人民己经懂得利用微生物发酵制酱、酿醋。19世纪末到20世纪30年代，发酵工业兴起，这时候的发酵产品主要有乙醇、乳酸、丙酮、丁醇、柠檬酸、蛋白酶等。20世纪40年代，通风搅拌培养技术的建立，促进了抗生素发酵工业的发展，并带动了各种有机酸、酶制剂、维生素、激素等大规模发酵生产，这一时期的发酵与酿造技术主要还是依赖对外界环境因素的控制。20世纪60年代末，人工诱变技术成功应用于氨基酸发酵工业。20世纪70年代初，基因工程的发展、完善和成功应用，使人类按照自己的意愿设计、培养菌株成为可能。20世纪80年代，DNA重组技术成功应用于微生物育种，使得人们按照预定的蓝图选育育种生产所需要的产物成为可能。然而，由于对微生物的整体认识水平有限，以及缺乏有效的关键技术，如基因编辑技术，工业生物技术在21世纪之前一直发展缓慢。
21世纪以来，在生物学、工程学、计算机科学、化学和物理学等学科的融汇中，合成生物学应运而生。作为一个快速发展的跨学科领域，合成生物学促使了生命科学从观测性、描述性、经验性的科学，跃升为可定量、可预测、工程性的科学，推动了从认识生命到设计生命再到创造生命的跨越。随着基因测序、基因编辑和基因合成技术的发展，合成生物学近年来发展迅速，己经深刻影响着化工、食品、能源、医疗健康和农业等领域的发展。在工业生物技术领域，利用合成生物学理念及技术构建功能强大、性能优越的基因线路、生物元件、细胞工厂及复杂的人工生物系统，不仅能够促进传统的氨基酸、有机酸、维生素、化工醇、健康糖等生物制造产业转型升级，而且可以实现自然生物不能合成或合成效率很低的化工产品的生物制造路线，进而大大拓展了生物制造的边界，触发新的产业变革，引领新的产业模式和经济形态，重塑物质财富增长方式。
本书以近几年取得重大突破的生物制造产品为例，着重介绍合成生物学在微生物育种及多酶分子机器构建中的应用。第二章介绍了氨基酸生物制造的研究进展，产品包括L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸及5-氨基乙酰丙酸；第三章介绍了有机酸生物制造的研究进展，产品包括柠檬酸、L-乳酸、衣康酸、乙醇酸、D-乳酸、3-羟基丙酸、丙二酸、丙酸、丁二酸、苹果酸、富马酸、丁酸、戊二酸和己二酸；第四章介绍了维生素生物制造的研究进展，产品包括维生素C、维生素B2和维生素Bi2;第五章介绍了有机醇生物制造研究进展，产品包括纤维素乙醇、1，3-丙二醇、丁醇、异丁醇和1，4-丁二醇；第六章介绍了脂肪酸类化合物生物制造研究进展，产品包括脂肪酸短链酯、脂肪醇类、烷烃类、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、神经酸、长链二元酸和ra-氨基十二烷酸；第七章介绍了芳香族化合物生物制造的研究进展，产品包括L-苯丙氨酸衍生物、L-酪氨酸衍生物、L-色氨酸衍生物等；第八章介绍了健康糖与甜味剂生物制造研究进展，产品包括D-阿洛酮糖、D-塔格糖、赤藓糖醇、阿洛糖醇、岩藻糖基功能寡糖、半乳糖基寡糖、甘露糖基寡糖、萜类甜味剂、黄酮类甜味剂、蛋白类甜味剂等；第九章介绍了合成生物学技术在甾体药物合成中的应用，包括对甾体药物起始原料、甾体药物关键中间体、甾体药物原料药的影响。第十章对工业生物技术进行了总结与展望。
本章参编人员：江会锋、刘玉万、卢丽娜、刘丁玉
第2章氨基酸工业合成生物学
2.1引言
氨基酸是蛋白质的基本组成单元，对人和动物的营养健康十分重要。随着技术的发展，氨基酸及其衍生物的产品种类己由20世纪60年代的50余种拓展到现在的1000余种，广泛应用于农业、轻工业和医药等领域。微生物一般可合成全部20种蛋白质氨基酸（图2-1），因此对微生物进行改造育种，再通过发酵可再生原
料是目前大部分氨基酸的主要生产方式。由于初期对微生物氨基酸代谢机制的理解不足以及遗传改造技术的缺乏，氨基酸生产菌种的选育较多使用诱变筛选的方法。合成生物学与工业生物技术的发展融合，催生了面向工业菌种创制的工业合成生物学，重塑了氨基酸生产菌种的开发和升级模式，多种氨基酸的生产水平大幅提升，合成转换率接近理论值，一些特殊的氨基酸也通过开发人工菌株和酶催化剂实现了生物合成。本章重点阐述了工业合成生物学推动氨基酸工业菌种创制和升级的研究进展。
2.2大宗氨基酸
2.2.1L-谷氨酸1.细胞表面结构变化与L-谷氨酸合成
L-谷氨酸的钠盐是味精的主要成分，在食品等工业中广泛应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum）可天然生产L-谷氨酸，研究者发现该菌株只能在生物素限制、添加吐温40等条件下生产L-谷氨酸，由此推测细胞表面结构遭到破坏，进而导致L-谷氨酸外排。从此细胞表面结构的变化与L-谷氨酸合成的关系也备受关注。在谷氨酸棒杆菌细胞的质膜研究中发现，脂肪酸和磷脂的含量与组成变化虽然影响L-谷氨酸的合成，但不是诱导其合成和分泌的主要因素(Nampoothiri et al.，2002）。在生物素亚适量和添加吐温40条件下，DtsR和AccBC组成的丙酰CoA羧化酶复合体是主要作用靶点，DtsR在上述条件下表达水平明显降低，进而通过减少脂肪酸的合成影响细胞膜结构；同时DtsR缺失还会影响a-酮戊二酸脱氢酶复合体（ODHC）的活性，导致a-酮戊二酸的代谢流转向L-谷氨酸合成（Kimura et al.，1999）。
此外，还有研究表明谷氨酸棒杆菌的细胞壁结构对L-谷氨酸合成和分泌的影响较大，参与L-谷氨酸的诱导生产。*先，在L-谷氨酸生产条件下，细胞壁中分枝菌酸的含量明显下降，生物素亚适量条件下短链分枝菌酸的含量明显增加，上述变化都有利于L-谷氨酸的分泌（Hashimoto et al.，2006）。其次，IstA作为一种二氨基庚二酸氨基转移酶，在温敏型高产菌株中，其IstA基因发生突变，导致菌株肽聚糖缺少酰胺化修饰，细胞外膜刚性降低，表现出对温度和溶菌酶敏感，并在高温条件下快速分泌L-谷氨酸（Hirasawa et al.，2000，2001）。Shi等（2020）通过反向代谢工程技术，鉴定出温敏型生产菌株TCCC11822中肽聚糖合成相关基因muA和murB的缺失，以及7个与细胞膜合成相关的突变，与菌株温敏特性及L-谷氨酸的外排相关。
2.机械敏感通道蛋白与L-谷氨酸分泌
研究人员在分析一株能在富含生物素的条件下生产L-谷氨酸的突变菌株时，发现NCgl1221(MscCG）的特定突变（如A100T）能够组成型分泌L-谷氨酸。MscCG与大肠杆菌(Escherichia coli）中机械敏感通道蛋白MscS的同源性较高，缺失后会抑制L-谷氨酸分泌，过表达可以提高诱导条件下L-谷氨酸的分泌，被认定为一种谷氨酸外排蛋白（Nakamura et al.，2007）。基于上述发现，研究人员进一步研究证实，MscCG确实具有机械敏感通道活性，L-谷氨酸通过被动扩散经MscCG穿过细胞质膜排出胞外（Hashimoto et al.，2012）。通过检测MscCG蛋白C端截短菌株的L-谷氨酸分泌能力，发现MscCG的N端结构域具有完整的L-谷氨酸诱导分泌功能，而缺失C端胞质外结构域的突变体无须任何诱导处理即可组成型生产L-谷氨酸，表明该部分对N端结构域有负调控作用（Yamashita et al.，2013）。在Z188等菌株中还存在另外一种机械敏感通道蛋白MscCG2，其在进化水平与MscCG相对*立，蛋白序列的一致性只有23%，能够回补MscCG缺失造成的菌株表型缺陷；MscCG2蛋白介导的L-谷氨酸外排同样受生物素亚适量和青霉素的诱导，而A151V突变体可以组成型外排L-谷氨酸（Wang et al.，2018a）。
3.L-谷氨酸生物合成的代谢调控
谷氨酸棒杆菌通过谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GluDH），以NADPH为辅酶，催化a-酮戊二酸和按根离子合成L-谷氨酸(B6rman et al.，1992）。a-酮戊二酸是L-谷氨酸合成和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA循环）
的代谢节点，其代谢流分配*先被关注。在生物素亚适量等条件下，ODHC活性显著降低，引发a-酮戊二酸积累，转向L-谷氨酸合成（Shimizu et al.，2003）；而在ODHC失活的菌株中提高GluDH的活性可以进一步提高L-谷氨酸的合成(Asakura et al.，2007）2006年，一种新型的ODHC调节蛋白OdhI被发现(Niebisch et al.，2006）。生物素亚适量等诱导条件下OdhI表达上调，且非磷酸化状态的OdhI比例明显上升，从而抑制ODHC活性，使代谢流转向L-谷氨酸合成（Kim et al.，2011）。此外，OdhI第132位赖氨酸残基的琥珀酰化修饰会降低其与a-酮戊二酸脱氢酶OdhA的相互作用，调控L-谷氨酸的合成（Komine-Abe et al.，2017）。鉴于ODHC在L-谷氨酸合成中的重要作用，针对其表达和酶活水平的调控作为重要策略被广泛用于L-谷氨酸菌种的设计和改造（Wen and Bao，2019）。
草酰乙酸是L-谷氨酸合成的另一关键代谢产物。四碳回补反应是在好氧条件下补充草酰乙酸，维持乙酰辅酶A(acetyl-CoA，乙酰CoA）进入TCA循环的重要途径，并在L-谷氨酸生物合成中发挥重要作用。谷氨酸棒杆菌中存在两条四碳回补反应途径，分别由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和丙酮酸羧化酶（PYC）催化固定1分子CO2，合成1分子草酰乙酸。由于PYC以生物素为辅酶，因此在生物素亚适量条件下其活性受到明显抑制，此时PEPC起主要作用（Sato et al.，2008）。而在添加吐温40条件下，PYC的反应通量明显提升（Shirai et al.，2007）。此外，谷氨酸棒杆菌中四碳回补反应途径还存在翻译后水平的调控。例如，PEPC的多个赖氨酸残基存在乙酰化或者琥珀酰化修饰作用，第653位赖氨酸的乙酰化修饰会显著降低PEPC活性，而在L-谷氨酸生产条件下，PEPC通过去乙酰化反应被激活，提高L-谷氨酸的产量（Nagano-Shoji et al.，2017）。
此外，L-谷氨酸是谷氨酸家族氨基酸合成的前体，其下游代谢影响菌株的生长和L-谷氨酸的产量。Li等（2021）通过谷氨酸生产菌株比较转录组分析，鉴定了一种新的调控谷氨酸代谢网络的转录调控因子RosR，其在L-谷氨酸生产菌株中显著上调，可以通过下调乳酸脱氢酶编码基因IdhA、谷氨酰胺合成酶编码基因glnA、乙酰-Y-谷氨酰磷酸脱氢酶编码基因argC、乙酰辅酶A羧化酶亚基编码基因dstRl等基因的表达，从而下调L-谷氨酸生物合成的竞争途径，同时抑制odhA的表达，提升L-谷氨酸产量。
4.基于合成生物技术的L-谷氨酸生产菌种的创制
通过糖酵解途径（glycolytic pathway或Embden-Meyerhof-Pamaspathway，
简称EMP途径）的丙酮酸脱氢酶E1p亚基AceE催化丙酮酸合成乙酰CoA释放1分子C〇2，降低了L-谷氨酸合成的原子经济性。双歧杆菌（Bifidobacteriumsp.）中的新酵解途径可以通过磷酸转酮酶和戊糖磷酸途径（PPP），在不损失碳的前提下合成乙酰CoA，提高葡萄糖合成L-谷氨酸的理论转化率。在谷氨酸棒杆菌中过表达磷酸转酮酶，可以明显提高L-谷氨酸的产量和转化率，为L-谷氨酸生产菌株的创制提供了新的改造策略（Liu et al.，2008）。在此基础上，Dele-Osibanjo等（2019）在谷氨酸棒杆菌中构建了一种生长依赖的进
展开
