第1章 好氧发酵过程中微生物群落结构及多样性分析
　　1.1 概述
　　1.1.1 畜禽粪便产生及处理现状
　　我国是农业生产大国。近年来，我国畜禽养殖行业发展迅猛，有学者预测， 2005～2030年，我国的猪、鸡肉等畜禽产品的产量将平均增长 2.5倍。21世纪以来，我国农产品供应也得到了大幅度的提升，据 2018年统计，我国人均供应粮食 184.09kg、蔬菜 504.14kg、水果 471.48kg，人均供应水产品 46.28kg、奶 22.03kg、蛋类 22.42kg、肉类 61.81kg。高产量、高供应量的背后带来了巨大的有机废弃物产生量，据 2016年统计（以下重量按干重计算），我国有机废弃物总产生量约为 20亿 t，其中秸秆约 7.9亿 t、畜禽粪便约 8.8亿 t、人粪尿约 1.03亿 t、污泥约 0.09亿 t、生活垃圾约 2.03亿 t，其中畜禽粪便占总废弃物产生量的 44%。畜禽粪便产生量巨大，且与之配套消纳的土地不足，即在集约化养殖与种养分离的双重压力下，畜禽粪便的处理成为难题。目前，我国畜禽粪便的处理方式主要为放置、丢弃及不合理的使用，有机废弃物的综合利用效率却不足 60%，这不仅造成了严重的环境污染问题，还是对资源的一种极大的浪费。
　　在环境污染方面，畜禽粪便的大量堆积导致环境日渐恶化，加重了 NH3、N2O、CH4、 H2S等气体的排放，造成气体污染；氮磷元素随堆积时间的延长，所产生的渗滤液沿地表径流进入水体，造成水体富营养化，沿地下径流进入地下水，污染地下水；粪便中的抗生素及病原微生物、杂草种子，如若处理不当，使用后易导致人畜、作物受害。基于此，畜禽粪便已成为农业面源污染中的重大问题，成为世界普遍关注的问题。但畜禽粪便等有机废弃物中含有丰富的营养成分，是植物养分、土壤有机质和生物能源的重要来源，据测算，有机废弃物中养分储量折合成氮磷钾分别是约 3000万 t、1500万 t和 3000万 t，已超过全年化肥养分的使用总量（约 6400万 t），如何提高畜禽粪便等有机废弃物的综合利用效率，将畜禽粪便等有机废弃物重新返还至农田中成为亟待解决的问题。现阶段，畜禽粪便等有机废弃物进入生态系统的主要方式之一是好氧发酵。
　　1.1.2 好氧发酵工艺发展现状
　　目前，对畜禽粪便处理的方式主要分为自然堆沤腐熟、好氧发酵和厌氧发酵 3种方式。好氧发酵是指在人工控制条件（水分、C/N和通风等）下，通过微生物的发酵，使有机物被降解，并生产出适宜于土地利用的产物的过程，其作为一种主要的资源化利用方式，包括以下 3种主要的堆肥工艺，即条垛式堆肥、槽式堆肥与反应器堆肥［《畜禽粪便堆肥技术规范》（NY/T 3442—2019）］。
　　1.1.2.1 自然堆沤腐熟法
　　自然堆沤腐熟法是将畜禽粪便堆置在一起或将其堆放入池中，经过一段时间的发酵后进行使用。这种方法在偏远地区的小农场或小农户中比较常见，因为其远离居民区，场地宽阔，畜禽粪便基本上能消纳，但是这并不适合于目前我国集约化畜禽养殖的粪便处理，一方面这些养殖场大多分布在城镇周边，另一方面，其也没有足够的土地进行配套消纳（李庆康等， 2000；廖青等，2013）。
　　1.1.2.2 条垛式堆肥
　　条垛式堆肥是一种典型的开放式堆肥，其特征是将混合好的物料堆成条垛进行好氧发酵，并通过机械周期性地翻抛进行发酵。翻堆频率为每周 3～5次，整个发酵过程需要 30～60d。条垛式堆肥主要包括动态条垛式堆肥、静态条垛式堆肥等。
　　条垛式堆肥工艺的主要优点：工艺简单，操作简便，投资少。其主要缺点：无法精确控制堆体的温度和 O2含量，发酵时间长，占地面积大，臭气不易控制，产品质量不稳定。
　　1.1.2.3 槽式堆肥
　　槽式堆肥一般在长而窄的被称作“槽”的通道内进行，槽壁上方铺设有轨道，在轨道上安装翻堆机，可对物料进行翻搅，槽的底部铺设有曝气管道，可对堆料进行通风曝气，是一类将强制通风与定期翻堆相结合的堆肥系统。槽式堆肥包括连续动态槽式堆肥、序批式动态槽式堆肥和静态槽式堆肥等。
　　发酵槽的尺寸一般根据处理物料量的多少及选用的翻抛设备型号来决定。翻抛机搅拌的过程是对堆体进行破碎、混匀的过程，避免了发酵过程中堆体过分密实，提高了堆体的疏松度，有利于对堆体进行充氧；同时通过翻抛的作用，可以使最底部物料和最上部物料都能经过高温过程，堆出的产品更加均匀。发酵槽底部安装有通风管道系统，通过强制通风来保证发酵过程所需的 O2。物料一般在入槽后 1～2d即可达到 45℃，发酵周期为 15～30d。
　　槽式堆肥工艺的主要优点：处理量大，发酵周期较短，机械化程度高，可精确控制温度和 O2含量，臭气可收集、易处理，不受气候影响，产品质量稳定。其主要缺点：设备较多，操作较复杂，土建成本较高。
　　1.1.2.4 反应器堆肥
　　反应器堆肥指将有机废弃物置于集进出料、曝气、搅拌和除臭为一体的密闭式反应器内进行好氧发酵的一种堆肥工艺。反应器堆肥包括筒仓式反应器堆肥、滚筒式反应器堆肥和箱式反应器堆肥等。
　　以筒仓式反应器堆肥为例，反应器高度一般为 4～6m，物料从仓顶加入，仓底出料，用高压涡轮风机强制通风供氧，以维持仓内物料的好氧发酵。物料发酵周期为 7～10d。
　　密闭式反应器堆肥工艺主要用于中小规模养殖场的有机固体废弃物（简称固废）就地处理。该工艺的主要优点：发酵周期短，占地面积小，不需要添加辅料，保温节能效果好，自动化程度高，密闭系统臭气易控制。其主要缺点：单体处理量小，大规模项目需要布置较多设备。条垛式、槽式和反应器堆肥工艺都有各自的优缺点（表 1-1），用户可以根据自己的原料、场地、生产规模、当地气候、环保政策、投资、产品出路等来选择最切合自身需求的堆肥工艺。
　　表 1-1 三种常见堆肥工艺的特点
　　通常条垛式堆肥适用于土地相对充裕，远离居民区，固定投资少的西北、东北等地区的中小型养殖场；槽式堆肥适用于土地面积较小，环保要求较高，固定投资高的大中型养殖场；反应器堆肥适用于土地面积小，环保要求高，立足就地处理的中小型养殖场。
　　1.1.3 好氧发酵过程中国内外微生物多样性研究进展
　　1.1.3.1 好氧发酵过程中微生物群落演替研究进展
　　堆肥过程是一种通过微生物介导的生物转化过程，通过微生物的作用能将畜禽粪便等有机废弃物中的大分子有机物质转换成为小分子物质、腐殖酸等，实现有机废弃物的减量化、无害化和资源化。但在堆肥的不同时期，优势微生物菌群发生了显著性变化。我们对堆肥过程中微生物变化的研究随着生物技术的发展而逐渐深入。在研究早期，通过传统微生物学的方法进行研究，发现在堆肥初期，主要是嗜温性细菌、真菌在发挥作用，通过分解小分子蛋白质、脂肪、糖类从而促进了堆肥过程中温度的升高；而在堆肥高温期，主要是嗜热性细菌、部分真菌和放线菌在发挥作用，开始分解半纤维素、纤维素等大分子有机物质；在堆肥后期，转换成嗜温性细菌、放线菌在发挥作用，开始分解大部分的纤维素及小部分的木质素，促进了堆肥腐殖质的生成，从而使堆肥腐熟。但通过平板培养的方法进行堆肥过程中微生物群落演替的研究具有一定的局限性，即通过平板能够培养获得的微生物仅占自然界微生物总量的0.1%～10%，数量非常少。
　　近年来，随着分子生物学技术的发展，高通量测序被广泛应用到堆肥微生物的研究中，推动了人们对堆肥过程中微生物的研究进程。通过门水平的研究发现，不同的堆肥过程，其微生物的群落主要由厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和绿弯菌门组成，在属水平主要是芽孢杆菌属占主导地位，起到了降解纤维素等大分子有机物质的作用。但对于不同的堆肥原料及堆肥工艺，其微生物的群落构成是存在部分差异的。例如： Xu等（2016）在羊粪中添加园林废弃物，堆肥前期主要是厚壁菌门（ 87.7%）和变形菌门（ 7.35%）占主导优势，且厚壁菌门占绝对优势，起到了对堆肥原料中糖类和易于降解的物质进行优先分解的作用，而这是进行有机废弃物降解的第一步，同时通过该类微生物的降解所产生的小分子碳水化合物更加有利于微生物的吸收利用；堆肥高温期堆肥微生物的群落结构发生了变化，厚壁菌门的相对丰度逐渐降低，而变形菌门、绿弯菌门的相对丰度分别增加了 23.47%、10.62%；堆肥后期，绿弯菌门的相对丰度增加至 52.52%，变形菌门的降低至 16.65%，放线菌门的相对丰度增加至 5.73%，放线菌门与堆肥前期和中期相比，占比提高 252倍，说明在堆肥后期放线菌门的微生物主要起到了对纤维素等大分子有机物质的降解作用。 Wang和 Zeng（2018）发现，在玉米、稻草共堆肥过程中微生物的群落结构也具有演替规律。随着堆肥过程的进行，厚壁菌门的相对丰度逐渐下降，变形菌门、拟杆菌门和放线菌门的相对丰度显著增加；而在属水平，占主导优势的由厚壁菌门中的芽孢八叠球菌属（ Sporosarcina）和芽孢杆菌属（ Bacillus）变为变形菌门中的纤维弧菌属（ Cellvibrio）和戴沃斯菌属（ Devosia），拟杆菌门中的哥利蒂杆菌属（Gelidibacter），放线菌门中的纤维单胞菌属（Cellulomonas）、Leucobacter和 Demequina。
　　1.1.3.2 好氧发酵过程中核心微生物组的研究进展堆肥过程中存在一类微生物组，贯穿堆肥始终，这些微生物称为关键微生物。关键微生物最初是由生态学家 Robert T. Paine于 1966年提出的。后来经过一代又一代研究学者的发展，在 2018年，Banerjee等提出了微生物生态学中关键微生物的定义：关键微生物是高度相关的群体，无论在空间和时间上是否丰富，它们个体或群体对微生物群落的结构和功能都产生相当大的影响。这些类群在微生物群落中有着独*而重要的作用，它们的清除会引起微生物群落结构和功能的巨大变化。值得注意的是，关键微生物与优势微生物是有显著差异的，基于生态学中对微生物优势种和关键种的定义，可知关键种虽然不一定是优势度较大的种，但是如果没有关键种，则会造成群落结构坍塌、其他物种灭绝和物种多度的巨大变化等。
　　多项研究显示，微生物共现网络的方法在分析微生物互作关系和识别关键微生物等方面具有较高的应用价值。例如： Hartmann等（2015）利用共现网络计算的方法，通过分析 10个最常见的门水平微生物的显著相关运算分类单元（ operational taxonomic unit，OTU），发现这些微生物类群具有促进有益生物生长和抑制有害生物生长的重要潜力；王鹏等（ 2018）在已知的共现微生物群中，基于相对丰度、相关性强度、风味贡献程度因素，发现发酵过程的核心微生物群为白酒风味演替的主要推动者；何国斌等（ 2017）在研究婴幼儿肠道菌群与抗生素作用关系的过程中，对分别取样自使用抗生素治疗的腹泻患儿、未使用抗生素治疗的腹泻患儿和健康婴幼儿的粪便进行高通量测序，在属水平分别绘制细菌相关性网络图，对比相关性结果后发现，抗生素的使用改变了菌属的连接度，同时增加了肠道菌群内部相关性的复杂程度。
　　不同分类水平的微生物共现网络分析形象地展现了微生物群落中的相互作用关系，并揭示了群落成员共享的生态位空间，更有利于筛选出群落中的关键种。利用共现网络方法分析好氧堆肥过程中微生物群落间的相互作用，确定关键堆肥微生物，可以更有针对性、更科学地指导堆肥过程，确保有机废弃物资源的可持续利用。
　　1.1.3.3 好氧发酵过程中潜在病原菌的研究进展畜禽粪便中存在大量人畜共患病原菌，主要有沙门氏菌（ Salmonella spp.）、梭状芽孢杆菌（ Clostridium spp.）、弯曲杆菌（ Campylobacter spp.）、单核细胞增生李斯特菌（ Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（ Escherichia coli）等。